The development and application of electrochemical nitric oxide sensor
Chen Xiaoxia1,2, Wang Ying 1, Hu Shengshui 1,2
（1 Department of Chemistry, Wuhan university, Wuhan 430072）
（2 State Key Laboratory of Transducer Technology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100084,P.R.China）
Abstract Nitric oxide (NO) plays important roles in physical and biological function, but there is a challenge to determine it’s concentration in biological system for it’s high spontaneous chemical reactivity, short half-life，low concentration in biological system and easily oxidized by O2。Date fluorescence and electrochemical methods were used to determine the NO concentration directly. Other methods, such as paramagnetic resonance spectrososcopy and UV-visible spectroscopy et al, were indirect. Compared with fluorescence, electrochemical method especially electrochemical sensor due to
its simple, sensitivity, excellent selectivity and real time performance was widely used to study NO in
biomedicine. This article summarized the development and application of electrochemical sensors developed in recent years form four directions.
Key words nitric oxide; electrochemical sensor; development and application
1 引言
大量的实验表明，NO是重要的生物信使分子，参与血管舒张调节、神经传递、炎症与免疫等过程，其广泛分布在脑、血管、肺、生殖等多种器官中, 且与高血压、心肌缺血、动脉硬化、哮喘等许多系统疾病有关。因此，寻找一种快速简便在线检测一氧化氮的方法成为化学与医学界普遍关心的问题。电化学方法尤其是电化学传感器由于其操作简单，灵敏度高，选择性好，又可实现直接检测而广泛应用在生物医学中有关一氧化氮的研究。目前，已有一些一氧化氮电化学传感器投入了市场。综合几年来有关一氧化氮电化学传感器的制备及其在生物医学中的应用，大致可分为以下几方面。

2 直接检测生物体系中存在的一氧化氮

一氧化氮电化学传感器广范应用于生物体中一氧化氮浓度的检测。这些传感器可分为两类：直接检测型传感器和催化检测型传感器。直接检测也是最早用来检测生物体系中一氧化氮的电化学传感器，主要有两种，一类是Shibuki[1]制备的一种传感器。该传感器是由密封在微玻璃管中长150-200m的铂丝，及装在管内的30 mM NaCl和0.3 mM HCl水溶液制备而成（见Figure 1）。二是 Zhang 等人用一氧化氮选择性气体透过聚合膜及一种阳离子交换剂Nafion聚合物修饰碳纤维极制备而成的传感器。2001年该小组[2]用这种传感器首次直接检测到老鼠肾


Figure 1. Schematic drawing of the Clark type NO microsensor developed by Shibiki
脏中一氧化氮浓度,并且检测到其浓度在肾切除过程中高于其正常浓度。另一类催化检测型一氧化氮传感器是基于一些物质自生或者是某些物质的聚合物的催化作用而制备的。最先开始于Malinski 等人[3] 制备的由电聚合镍-四甲基卟啉（NiTMHPP）/Nafion双层复合膜修饰碳纤维电极（＝0.8 m, length=6 m）（见 Figure 2）。该传感器响应时间快（<10ms），灵敏度高，检测限约10nM，超过NO浓度20倍的NO2-不影响NO的测定，该电极已成功地应用于猪动脉单个内皮细胞中NO释放的检测。此后，金属卟啉类修饰电极制备的一氧化氮传感器发展迅速， 且已经超微型化、商品化。到目前为止，这类传感器是一种测定生物体系中一氧化氮应用最为广泛的的电化学传感器。1998年Birder等人[4]用卟啉类传感器检测到膀胱上皮细胞在肾上腺素及辣椒素等神经毒素的加入均可引起短暂的一氧化氮的释放，释放量分别是50 nM — 1.4 M 和 50 — 900 nM，说明膀胱上皮细胞与神经细胞一样均可以释放出一氧化氮。2002年Malinsiki小组[5]用（NiTMHPP）/Nafion修饰碳纤维一氧化氮传感器直接测定了不同情况下左心室壁细胞中释放的一氧化氮的含量，结果表明心室壁中心释放的一氧化氮含量最高达1.230.20 M, 最低为0.900.15 M。这个研究结果有利于研究一氧化氮和受损心肌之间的关系。卟啉类电化学传感器还用于了人体血小板[6]、猫骨髓[7]等]其它一些组织[8-9]中一氧化氮的含量的测量。金属酞菁类化合物是与金属卟啉类化合物结构类似的大环化合物，1997年O.Raveh[10]制备了金属酞菁一氧化氮电化学传感器并应用于活体melanoma细胞NO释放的原位检测，取得了良好的效果。除了金属卟啉和金属酞菁类修饰电极制备的一氧化氮电化学传感器外，其他修饰材料制备的电化学传感器也应用于生物体中的一氧化氮的检测。1998年 Park 等人[11]制备的非导电膜修饰电极一氧化氮传感器用于老鼠脑皮细胞中释放一氧化氮的检测，检测信号为422nM和752nM,检测结果证明了Sato等用旋转诱捕法测试的结论，即第一个响应电流是由原生型一氧化氮合酶作用释放出的一氧化氮的氧化，第二个响应电流是诱导型一氧化氮合酶作用产生的一氧化氮的氧化电流。2005年王亚珍等人[12]用多壁碳纳米管修饰碳纤维电极检测了鱼线粒体中一氧化氮的含量（见Figure3）。如图中所示，当传感器插入含有生物样品的PBS溶液后，电流响应增加，300s后达到电流平台，该响应为生物体中内源型L-arg在一氧化氮合酶作用下释放的一氧化氮而引起的。在400s处加入L-arg电流响应继续增加，几百秒后电流达到最大，该响应电流为外源型L-arg在一氧化氮合酶作用下释放一氧化氮的响应电流。总的一氧化氮释放量约为0.4M。


同年王亚珍等人[13]用聚甲苯胺蓝/Nafion修饰玻碳电极制备的一氧化氮传感器对老鼠肝脏
组织匀浆中释放的一氧化氮检测。如 Figure 4 所示，未加入生物样品时，在200s处加入L-arg无电流响应，在含有生物样品的溶液中加入L-arg后，观察一个氧化峰，该峰电流随着时间逐渐增加300s处达到电流平台，在约400s处加入L-arg的同系物L-NNA, 抑制了一氧化氮的释放，电流逐渐降低，根据最高电流响应计算一氧化氮含量约为224M。

3 一氧化氮在生物体中作用的研究

一氧化氮电化学传感器不仅用与生物体中一氧化氮含量的检测，也广泛用于一氧化氮在生物体中所起作用的研究。
1996年镍卟啉/Nafion修饰碳纤维电极制备的一氧化氮传感器[14]，用来研究了基因缺乏的癫痫病老鼠中一氧化氮浓度变化，当一定剂量的抗癫痫病药物注入老鼠体中后，检测到一氧化氮的信号增加。实验结果说明一氧化氮具有抗癫痫的作用。1998年，Noiri等人[15]用含有KCl/硝化纤维树脂/气体透过硅膜修饰Pt-Ir合金电极制备出一氧化氮传感器，建立了生物体内皮细胞一氧化氮释放量的检测方法，并研究了在内皮细胞转移中一氧化氮的作用。实验发现血管内皮生长因子(VEGF)可刺激一氧化氮从内皮细胞微脉管中释放出来，致使内皮细胞顺利转移。另一组关于受伤内皮细胞愈合实验发现，一氧化氮合酶抑制剂使VEGF刺激细胞转移的速度显著减慢。该实验结果表明一氧化氮在内皮细胞转移过程中起重要的作用。Yamauchi 等人[16]用一氧化氮敏感电极监测在培养的老鼠脑层神经元中加入谷氨酸盐后一氧化氮含量的变化。培养7天后，在培养介质中加入谷氨酸盐或者L-精氨酸，发现一氧化氮的浓度增加，神经元死亡量增加。同时，MK-801(300微米)和克他命（300微米）预处理证明是谷氨酸盐而不是L-精氨酸使一氧化氮浓度增加，神经元死亡。该实验结果说明刺激性的氨基酸盐诱导一氧化氮浓度增加从而导致神经元的死亡，也即一氧化氮浓度增加可导致神经元的死亡。在出血性休克中短暂性肌缺血萎缩再灌注过程肝脏受损研究时[17], 一氧化氮电化学传感器检测到在肌缺血性萎缩再灌注过程中伴有由各种一氧化氮合酶释放的一氧化氮信号的增加。说明一氧化氮对肝脏灌注后损伤具有恢复作用。一氧化氮电化学传感器还可用于了猪冠状动脉和静脉中一氧化氮作用的研究[18]，结果证明一氧化氮在动脉中的作用要远大与其在静脉中所起的作用。


Figure5 Effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) on nitric oxide (NO) production and endothelial cell migration.
A: representative recordings (n = 4) of VEGF
induced release of NO from cultured
endothelial cells. B:dose-response curve
of VEGF-induced endothelial cell migration
in a Boyden apparatus. * P < 0.05 vs.
control (n = 4). C: VEGF-induced endothelial cell migration requires functional NO synthase.



4 药物研究
一氧化氮在生物体中起着重要的作用，其含量过多或者过少均能引起各种疾病。目前临床上经使用一些能够释放出一氧化氮的药物（如硝普钠及其它亚硝基硫醇类药物）来治疗因NO含量低而引起的高血压、急性心力衰竭等疾病。因此开展这类药物的研究从而掌握和控制这些药物在生物体中的用量显得尤为重要。一氧化氮电化学传感器可以方便、快速的对这些药物释放的一氧化氮行为进行检测。1998年mayer等人[19]在使用WPI(世界精密仪器)公司提供的一氧化氮电化学传感器测定亚硝基硫醇类药物的报道中指出，Cu2+及谷光甘肽在亚硝基硫醇类药物释放一氧化氮过程中起了重要作用，首先谷光甘肽与亚硝基硫醇反应形成RSSR，而后Cu2+被硫醇盐还原为Cu+，Cu+能够催化亚硝基硫醇类药物释放一氧化氮，而一氧化氮的释放速率取决于Cu2+的浓度。Zhang等人[20]用一氧化氮微传感器对S-亚硝基-N-乙酰基-D,L-青霉胺（SNAP）在水溶液中一氧化氮释放的研究中发现，溶液的pH、温度及氧气的含量均影响一氧化氮的释放，同时给出了释放出的一氧化氮浓度与SNAP及氧气浓度的关系式：[NO]=(k[SNAP]/kb[O2])1/2 k和kb分别为反应SNAP1/2 RSSR + NO及NO + 1/2 O2  NO2的反应常数。这些研究有助与生物体中药物作用及控制其用量的研究。
5 其他
血液中的血红蛋白具有运输氧的作用，但是由于其分子中心具有铁离子，也可与一氧化氮结合。 Hakim 等人[22]用WPI安培传感器研究了水溶液中一氧化氮和血红蛋白之间的结合作用，实验结果表明一氧化氮与血红蛋白是以4：1的配位结合，其结合速率为2105M-1.s-1。因为一氧化氮在有血红蛋白存在下会很快与其结合而消失，得出一氧化氮是一种自体有效物质而非循环体液物质。
总之,一氧化氮电化学传感器由于其自身的特点，已经在生物医学上得到了广泛的应用。而且随着生物医学的发展，科学家对于一氧化氮在生物体中究竟通过怎样的途径来实现其生理作用将有更大的兴趣。因此，一氧化氮电化学传感器将会更加受到重视。
（感谢国家自然科学基金Nos.30370397 和60571042的支持）

参考文献
[1].shibiki K. An electrochemical microprobe for detecting nitric oxide release in brain tissue. Neurosci. Res. 1990, 9,69-72
[2] Levine DZ, L, Iacovotti M, Zhang XJ, et al.Real-time profiling of kidney tubular fluid nitric oxide concentrations in vivo. Am J Physiol Renal Physiol, 2001, 281, F189–F194
[3] Malinski T, Taha Z. Nitric oxide release from a single cell measured in situ by a
porphyrinic-based microsensor. Nature, 1992, 358,676-678
[4 ] Birder. LA, Apodaca G, Kanai AJ et al. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. Am J Physiol Renal Physiol, 1998, 275, F226-F229.
[5] Balbatun. A, Louka. F.R, Malinski. T. Dynamics of nitric oxide release in the cardiovascular system. Acat biochim polonica.2003, 50(1). 61-68.
[6] Malinski T, Radomski M.W, Taha Z et al. Direct electrochemical measurement of nitric oxide released from human platelets, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993, 194,960-965
[7] Wu WC., Wang Y., Su CK, et al. The nNOS/cGMP signal transducing system is involved in the cardiovascular responses induced by activation of NMDA receptors in the rostral ventrolateral medulla of cats. Neurosc.lett, 2001, 310 (3).121-125.
[8] Dobrucki WL, Burewicz A, Malinski T. Porphyrinic Nanosensor for Measurement of Nitric Oxide in the Cardiovascular System. Analytical Sci. 2001, 17,1583-1588
[9] Xian YZ; Zhang W; Xue J. Direct measurement of nitric oxide release from the rat hippocampus. Anal Chim Acta, 2000, 415, 217-233
[10] Raveh O, Peleg N,.Bettleheim A, et al. Determination of NO production in melanoma cells using an amperometric nitric oxide sensor. Bioelectrochem. Bioenergtics, 1997, 43, 19-25
[11] Park JK, Tran PH, Chao JKT, et al. .In vivo nitric oxide sensor using non-conducting polymer-modified carbon fiber. Biosensors & Bioelectronics, 1998, 13,1187-1195
[12] Wang YZ, Li Q, Hu SS. A multiwall carbon nanotubes film-modified carbon fiber ultramicroelectrode for the determination of nitric oxide radical in liver mitochondria.
Bioelectrochemistry, 2005, 65,135-142
[13] Wang YZ, Hu SS, Mao XQ, Tian QL. A novel nitric oxide biosensor based on electropolymerization poly (Toluidine Blue) film electrode and its application to nitric oxide released in liver homogenate. Biosensors & Bioelectronics, in press
[14] Faradji HC, Rousset C, Cespuglio R. Nitric oxide (NO) in brain: detection by voltammetric methods- role in a rat model of absence epilepsy. 1st Annual International IEEE-EMBS Special Topic Conference on Microtechnologies in Medicine & Biology. 2000,October 12-14, Lyon France
[15] Noiri E, Lee E, Testa J, et al. Podokinesis in endothelial cell migration: role of nitric oxide Am J Physiol Cell Physiol, 1998, 274,C236-C244.
[16] Yamauchi M, Omote K, Ninomiya T. Direct evidence for the role of nitric oxide on the glutamate-induced neuronal death in cultured cortical neurons. Brain Res. 1998, 780(2).253-9
[17] Lhuillier S, Crova P, Cespuglio R, et al. Hepatic nitric oxide production is in part non enzyme dependent during hemorrhagic. Anesthesiology, 2003; 99,A719-A725
[18] Zhang RZ, Yang Q, Yim APC, et al.Different role of nitric oxide and endothelium-derived hyperpolarizing factor in endothelium-dependent hyperpolarization and relaxation in porcine coronary arterial and venous system. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 2004, 43, 839 –850.
[19] Pfeiffer S, Schrammel A, Mayer B, et al. Electrochemical determination of S-nitrosothiols with a Clark-type nitric oxide electrode Anal. Biochem. 1998, 258, 68-73.
[20] Zhang XJ, Cardosa L, Broderick M, et al. Novel calibration method for nitric oxide microsensors by stoichiometrical generation of nitric oxide from SNAP. Electroanalysis, 2000, 12,425-428.
[21] Hakim T S, Sugimori K, Camporesi E M et al. Half-life of nitric oxide in aqueous solutions with and without haemoglobin. Physiol. Meas. 1996, 17,267-277